Durante miles de años, la preservación de la comida ha sido fundamental para los humanos, y ha condicionado su supervivencia y expansión en cualquier clima. Durante las décadas recientes, la pasteurización y esterilización han tenido un gran crecimiento, especialmente en la conservación de los productos alimentarios, dispositivos médicos y farmacéuticos. Mientras que los procesos clásicos, que utilizan calor no se pueden usar para productos que sean sensibles a la temperatura, ha habido un gran rechazo a procesos basados en la irradiación o productos químicos ( tales como el peróxido de hidrógeno o el óxido de etileno) por muchas razones incluyendo costes, seguridad y cuestiones medioambientales.
Los organismos vivos son sensibles a su entorno en el que mantienen su actividad metabólica dentro de estrechos límites de temperatura, pH, presión hidrostática y composición química, aunque una gran variedad de organismos simples son capaces de vivir bajo extremas condiciones ( p. eje bacterias termofílicas en zonas de mares profundas).
Desde hace tiempo, los tratamientos con altas presiones se han usado para el control y esterilización de las industrias alimentarias, - especialmente en Japón, donde la irradiación nunca ha sido aceptada-, como una alternativa al tratamiento con temperatura, que generalmente degrada la calidad del producto ( aspecto, sabor, contenido vitamínico, etc). Sin embargo, la presión hidrostática requerida para una esterilización eficiente es extremadamente alta ( 4000-8000 bar y los tiempos de tratamiento son también considerables, lo que incrementa los costes de una manera que lo hacen incompatible con lo que cualquier mercado está dispuesto a pagar.
Desde hace unos 20 años o más se conoce la posibilidad de utilizar fluidos supercríticos, como una variante mucho más barata en varios procesos, trabajando a menores temperatura, donde el producto entra en contacto con dióxido de carbono, adicionado con agua, etanol u otros aditivos, tales como ácido acético o peróxido de hidrógeno.
Más recientemente, se ha puesto mucha atención en la pasteurización de productos alimenticios por fluidos supercríticos, con especial atención a la inactivación de esporas, que se sabe son muy resistentes al calor, radiación y agentes químicos. Además, algunos investigadores trabajaron en la inactivación de virus en fracciones de plasta o implantes.
Un fluido supercrítico (FSC) es cualquier sustancia que se encuentre en condiciones de presión y temperatura superiores a su punto crítico que se comporta como “un híbrido entre un líquido y un gas”, es decir, puede difundir como un gas (efusión), y disolver sustancias como un líquido (disolvente). Los FSC se caracterizan por el amplio rango de densidades que pueden adoptar. Por encima de las condiciones críticas, pequeños cambios en la presión y la temperatura producen grandes cambios en la densidad.
En un diagrama de fases clásico, las curvas de fusión, sublimación y vaporización muestran las zonas de coexistencia de dos fases. Tan solo hay un punto de coexistencia de tres fases, el llamado punto triple (PT). El cambio de fase se asocia a un cambio brusco de entalpía y densidad. Pero por encima del punto crítico (PC) este cambio no se produce, por tanto, podríamos definir este punto como aquel por encima del cual no se produce licuefacción al presurizar, ni gasificación al calentar; y por ende un fluido supercrítico es aquel que se encuentra por encima de dicho punto.
Figura 1.- Diagrama de fases típico de un fluido supercrítico.
Estas son las características comunes a los fluidos supercríticos:
- No existe interfase gas-líquido
- La compresibilidad isotérmica se hace infinitamente positiva
- El coeficiente de expansión térmica es infinito y positivo
- La entalpía de vaporización es cero
- Si la densidad se mantiene constante e igual a la densidad crítica la capacidad calorífica a volumen constante tiende al infinito
- La densidad por encima del punto crítico depende básicamente de la presión y la temperatura, pero en cualquier caso está más cercana a la de los líquidos que a la de los gases. La densidad aumenta si lo hace la presión a temperatura constante y si disminuye la temperatura a presión constante.
- La viscosidad es mucho más baja que la de los líquidos, lo que le confiere propiedades hidrodinámicas muy favorables
- La bajísima tensión superficial permite una alta penetrabilidad a través de sólidos porosos y lechos empaquetados.
- Mayores coeficientes de difusión (difusividad) que en líquidos por lo que la transferencia de materia es más favorable
En este primer artículo, expondré de forma breve los fundamentos de la aplicación de los fluidos supercríticos a la esterilización, para pasar en un artículo posterior a hacer un análisis somero de los procesos y la tecnología usada.
DEFINICIONES
Para clarificar, si fuera necesario los términos usados a lo largo de este artículo, a continuación incluyo algunas definiciones estándar:
Esterilidad: es la ausencia de microorganismos viables. La esterilidad no se puede garantizar con test. Se tiene que asegurar por la aplicación de métodos de producción validados de acuerdo con los protocolos definidos por las autoridades de control.
Esterilización: el acto de eliminar todos las células vivas de algún objeto o remover, matar o inactivar todos los microorganismos incluyendo formas vegetativas y esporas.
Validación: para validad los procesos de esterilización, se usan preparaciones estandarizadas de microorganismos seleccionados ( denominados indicadores biológicos). Generalmente consisten en una población de esporas de bacterias. Las especies recomendadas por la Farmacopea Europea y Americana son Geobacillus stearothermophiluspara esterilización por gas o vapor, Bacillus subtilis para esterilización por calor seco o gas,Bacillus pumilus para irradiación y Pseudomonas diminuta para filtración estéril.
Tasa de supervivencia, factor de reducción y eficacia de la esterilización: la definición de la eficacia de la esterilización a menudo proviene del ratio de supervivencia del número de microorganismos viables después de la esterilización (N) con respecto al número de microorganismos antes de procesado (No), y expresado como un factor de reducción o inactivación DI=-log10N/No
Cuanto más alto sea el número, mayor es la eficacia del proceso.
Cinética de la esterilización: para un proceso dado, operado en condiciones dadas, los cambios en la población microbiana frente al tiempo se describe generalmente como la curva siguiente log10N/No=-t/D donde D es el tiempo de reducción decimal o el tiempo requerido para una reducción de un –log en la población microbiana, por analogía con la cinética de primer orden para los modelos de reacción química. Hay modelos alternativos desarrollándose para explicar la cinética de inactivación microbiana cuando la linealidad de los datos es cuestionable.
Nivel de aseguramiento de la esterilidad: SAL es la probabilidad de no esterilidad al examinar una población. Es un valor establecido por estudios de validación. Generalmente se establece un valor de 10-6 como aceptable.
Pasteurización: se refiere a un tratamiento con calor moderado, inventado por Pasteur, llevando a la inactivación de microorganismos sin una degradación significativa. Se usa fundamentalmente en alimentación. Por extensión ,también se usa para designar otros procesos aplicables, tales como tratamientos con dióxido de carbono. La diferencia entre la esterilización y la pasteurización es que esta última no mata las esporas.
EFECTOS BIOLÓGICOS DE LOS FLUÍDOS SUPERCRÍTICOS EN LOS MICROORGANISMOS
Inactivación de microorganismos.
Algunos trabajos muestran que el dióxido de carbono y el óxido nitroso, incluso a bajas presiones ( por debajo de la presión crítica) inhiben el crecimiento e incrementan la tasa de inactivación de los microorganismos, durante los tratamientos con irradiación o con calor. Los tratamientos con calor a 50-55ºC en presencia de dióxido de carbono a 6 bar tiene el mismo efecto letal en algunas bacterias, hongos y levaduras que el tratamiento a 60-65ºC en presencia de aire, o en otras palabras, operando con este gas se podría reducir por al 50% el tiempo de pasteurización a una temperatura dada.
La comparación de las curvas de supervivencia de los microorganismos en contacto con gases presurizados, con el nitrógeno, etano o propano, con un fluido sub/super-crítico ( dióxido de carbono, etano, propano), claramente demuestra que el efecto bactericida de estos fluidos no se puede atribuir a la presión hidrostática en el rango de decenas o centenas de bar, sino a las interacciones específicas que dependen de la naturaleza química del fluido. Por ejemplo, el nitrógeno es menos eficiente que el dióxido de carbono, mientras que el óxido nitroso y el propano son muy eficientes en la inactivación celular. Por otra parte, se conoce desde hace tiempo la capacidad del dióxido de carbono para la inhibición del crecimiento microbiano, facilitando la conservación de alimentos empaquetados, aunque esta inactivación es reversible. Incluso a presiones tan bajas como 6 bar, este gas exhibe un significativo efecto bactericida o bacteriostático. Es más, este efecto se encuentra definitivamente soportado con la comparación del número de decaimiento de células de varios microorganismos cuando se someten a una muy alta presión con o sin dióxido de carbono.
De manera que no hay duda de que el efecto bactericida está causado por interacciones específicas entre la célula viva y el fluido de tratamiento que se disuelve dentro de la célula.
Muchos autores han propuesto mecanismos relacionados con la alteración de las membranas celulares y el metabolismo interno y pueden resumirse en : ruptura/perforación de paredes celulares, inactivación de algunas enzimas clave, inactivación de bioreacciones, perturbación del balance electrolítico celular, etc.
Inactivación de esporas.
En lo referente a las esporas, no es sorprendente ver que la resistencia a la inactivación por contacto con un fluido sub/super-crítico sea mucho más alto que las formas vegetativas:
- La mayoría de las esporas no se ven afectadas por el contacto con dióxido de carbono supercrítico a temperaturas medias ( <60ºC), incluso a altas presiones ( 2500 bar).
- De acuerdo con algunos autores la temperatura parece ser el parámetro clave. La inactivación de esporas se ve dramáticamente mejorada a una temperatura superior a 70ºC.
- Los valores de pH ligeramente ácidos también favorecen la inactivación de esporas.
- La adición de un fuerte oxidante, como peróxido de hidrógeno, ter-tributil hidroperóxido o una mezcla de ambos, ácido peracético o ácido trifluoroacético incluso a muy bajas concentraciones, permite alcanzar una alta eficacia a temperaturas intermedias.
- Muchos otros compuestos, como metanol, etanol, acido fórmico, ácido acético, ácido succínico, ácido fosfórico se están estudiando como aditivos al dióxido de carbono, con una limitada inactivación en la mayoría de los casos.
- También se está estudiando la combinación con campos eléctricos, como pretratamiento, seguidos del dióxido de carbono a alta presión y 40ºC.
Los mecanismos de inactivación de las esporas todavía no se conocen bien, aunque parecen estar causados por la perforación de las capas externas de las esporas.
Inactivación de virus.
La contaminación por virus es una preocupación en todas los bio-productos de origen humano: fracciones de sangre/plasma, implantes de órganos / tejidos, o incluso r-ADN preparado mediante técnicas de biotecnología. Todos estos productos son muy frágiles con respecto a la temperatura, irradiación y agentes químicos, por lo que la inactivación de virus a baja temperatura por fluidos supercríticos es una técnica muy interesante.
La primera investigación al respecto fue publicada por Stahl y al. Quien encontró una débil inactivación ( 2log10) de Coliphage a muy alta presión de dióxido de carbono (2500 bar). El mismo tipo de virus fue completamente inactivado por dióxido de carbono a 300 bar y 50ºC con un tiempo de contacto de 30 minutos en un medio acuoso y el fluido disperso en “microburbujas”.
En 1990 dos grupos encontraron resultados atractivos en el procesado de fracciones de plasma. El primer sometió todas las muestras a óxido nitroso supercrítico a 250 bar y una temperatura de entre 37 y 50ºC durante 2 horas. El óxido nitroso se prefirió al dióxido de carbono ya que no produce una bajada del pH y por lo tanto una desnaturalización irreversible de las proteínas.
El óxido nitroso se mostró eficiente contra la mayoría de los virus, pero la inactivación es mayor para virus con cápsula que los que carecen de ella, probablemente debido a la interacción con los lípidos de su envoltura.
Más recientemente, se ha procedido a la desinfección de varios virus en biomateriales por contacto con dióxido de carbono a 40-50ºC y 160 bar durante 45 minutos, demostrando que el dióxido de carbono supercrítico puede inactivar de forma efectiva los virus en un biomaterial sensible al calor sin un descenso significativo en la bioactividad de ese material.
Las interacciones con la envoltura de los virus, parecen ser las causas predominantes de la inactivación de estos. Esto se soporta con el ejemplo de la cubierta lipídica del virus Sindbis que es extremadamente resistente al tratamiento con altas presiones hidrostáticas ( hasta 7000 bar) mientras que se inactiva rápidamente en presencia de un fluido supercrítico ( dióxido de carbono u óxido nitroso puros).
